Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia - tömegspektrometria (HPLC-MS)

A folyadékkromatográfia-tömegspektrometria módszerekkel ma már hőérzékeny vegyületeket tartalmazó összetett minták vizsgálata is rutinszerűen elvégezhető. A folyadékkromatográfia esetében sokkal több problémát kell megoldani a kapcsolat létrehozásakor, mint a gázkromatográfia esetében.

  1. A LC-ből kilépő mozgófázis folyadék, légköri nyomás és viszonylag alacsony hőmérséklet (20-50 °C) jellemzi, míg az MS-sel gázhallmazállapotú ionokat vizsgálunk, a készülék vákuumban, és gyakran magas ionforrás-hőmérsékleten dolgozik.

  2. Az LC-nél a minta illékonysága nem játszik szerepet, míg az MS-nél ez meghatározó tényező.

  3. Az LC-nél elvileg nincs molekulatömeg-korlát, míg az MS-nél a detektálható tömegtartomány az analizátor típusától függ

  4. Az LC elválasztásoknál gyakran alkalmazunk nem-illékony puffereket, amit az LC-MS illesztőegységek, illetve az MS ionforrások nem tudnak kezelni. Ezek alkalmazását lehetőleg kerüljük a kapcsolt technikáknál.

Napjainkban az LC-MS kapcsolás már nem igényel bonyolult illesztőegységeket, az atmoszférikus nyomáson működő ionizációs technikák (pl. ESI, APCI, APPI) megjelenésével közvetlenül össze lehet kapcsolni a két készüléket, az LC oszlopról lejövő eluenst közvetlenül be lehet vezetni az MS ionforrásba. Nincs univerzális technika, a feladat megoldásához meg kell találni a megfelelő készüléket (ionforrás-analizátor kombinációt). Poláris, ionos mintáknál célszerű az ESI ionforrást választani, míg kevésbé poláris vegyületeknél az APCI ionizáció előnyösebb lehet. A mozgófázis áramlási sebessége és összetétele is befolyásolja az ionizáció hatékonyságát. Például nano-LC elválasztást követően, ahol az áramlási sebesség 10-1000 nl/perc tartományban van, nanoESI ionforrást kell alkalmazni, míg a konvencionális LC oszlopoknál (3,2-4,6 μm belső átmérő, 0,5-2,0 ml/perc áramlási sebesség) akár még egy folyadékosztót (szplittert) is célszerű beilleszteni az ESI ionforrás elé.

Szénhidrátok, aminosavak, peptidek, nukleinsavak, egyéb hőérzékeny természetes eredetű szerves anyagok, gyógyszer alapanyagok, vitaminok, stb. elemzésében egyre elterjedtté válnak az LC-MS kapcsolt módszerek.

Gyakorlat leírása

A kapcsolt technikák közül a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiához kapcsolt tömegspekrométer laboratóriumi gyakorlat során a hallgató betekintést kap a HPLC készülék felhasználó szintű használatába, egy élelmiszeranalitikai vizsgálati módszer alkalmazásába és az alapvető kromatográfiás összefüggések gyakorlatban történő meghatározására és értelmezésére.

HPLC-MS készülék

A gyakorlat során a hallgató az HPLC-MS készülékkel, a készüléket vezérlő és mérési eredményeket kiértékelő szoftverrel ismerkedik meg, valamint oktató irányításával elvégzi a laboratóriumi gyakorlatra kiadott feladatot.

HPLC-MS készülék felépítése: Agilent 1100-1200, Agilent, USA

  • Eluenstartó edények: folyadéküvegek

  • Eluens gáztalanító egység: Micro vacuum degasser

  • Szivattyú: Binary pumps

  • Oszloptermosztát: Thermostated column compartment

  • Automata mintaadagoló rendszer: Autosampler

  • Detektor: Agilent LC-MSD-TRAP-XCT_plus

  • Agilent ChemStation and Agilent LC/MSD Trap vezérlő és kiértékelő szoftver

Állófázis: RP-C18 (fordított fázisú állófázis) az elválasztási feladattól függően változó technikai kivitelezésű és gyártmányú.

Mozgófázis: az aktuális gyakorlatnak megfelelő eluens ill. eluensek alkamazása.

Kapszainoidok kimutatása növényi extraktumból (Minta feladat)

Állófázis: Gemini C18 column (4.6×50 mm, 3 μm, Phenomenex, USA)

Mozgófázis: A eluens: 0,5 v/v% CH3COOH vizes oldat

B eluens: 0,5 v/v% CH3COOH acetonitril oldat.

Vizsgálati minták: 1.) Kapszaicin standard

2.) Dihidrokapszaicin standard

3.) Fűszerpaprika

10.3. ábra - Kapszaicin és dihidrokapszaicin szerkezeti képlete

Kapszaicin és dihidrokapszaicin szerkezeti képlete

Standard oldatok készítése: A kapszaicin és dihidrokapszaicin oldatokból a laboratóriumi gyakorlat vezetője által meghatározott koncentrációjú standard oldatokat készítünk acetonitril - víz oldószer eleggyel.

Paprika extraktum készítése: Erős szárított fűszerpaprika (Chili paprika) őrleményből 0,1 g mintát analitikai pontossággal bemérünk 5 ml-es normállombikba, majd acetonitrillel jelre töltjük. Az így elkészített törzsoldatot 15 percre ultrahangos fürdőbe helyezzük. Az ultrahangos kezelés után az oldatot centrifugáljuk, a felülúszóból mintát veszünk. 0.45 μm Millipore mintaszűrővel leszűrjük és 1 μl vizsgálati mintát injektálunk a HPLC-MS készülékbe.

Standard vegyületek MS spektrumának meghatározása

A kapszaicin és dihidrokapszaicin standard mintaoldatokat közvetlenül a tömegspektrométerbe injektálásával és a detektor különböző paramétereinek változtatásával adja meg a vizsgálandó vegyületek MS és MS/MS spektrumát. Határozza meg a vizsgálati m/z értékeket.

Standard hatóanyag oldatok retenciós idejének meghatározása

A standard oldatok felhasználásával a beállított HPLC-MS módszer segítségével határozza meg a komponensek retenciós idejét.

Minőségi azonosítás

Az HPLC-MS vizsgálati eredményekből végezze el a minőségi azonosítást, a retenciós idők és az azokhoz tartozó MS és MS/MS spektrumok segítségével.

Paprika extraktum hatóanyagainak mennyiségi meghatározása

Készítse el a hatóanyagok kalibrációs oldatait (3 pontos kalibráció), és végezze el a kalibrációs méréseket (3 párhuzamos injektálás), majd injektálja a paprika extraktum mintát is (3 párhuzamos injektálás). A kapott kromatogramok alapján készítse el a kalibrációs egyeneseket, valamint számolja ki a fűszerpaprika kapszaicin és dihidrokapszaicin tartalmát 1mg szárazanyagra vonatkoztatva.

Beadandó feladatok és vizsgálati eredmények

  1. Röviden foglalja össze a HPLC-MS elméletét alkalmazási területek felsorolásával.

  2. Rajzolja fel a gyakorlat során alkalmazott HPLC-MS készülék blokksémáját. Magyarázza el a készülék részeit és határozza meg a funkciójukat.

  3. HPLC kromatogramok, MS és MS/MS spektrumok kiértékelése a kapott vizsgálati eredmények összefoglalása.

  4. Adja meg a fűszerpaprika kapszaicin és dihidrokapszaicin tartalmát 1mg szárazanyagra vonatkoztatva

Kérdések

  1. Mit nevezünk kromatogramnak?

  2. Egy kromatogramról milyen információkat tud leolvasni?

  3. Egy kromatogram alapján hogy tudunk minőségi azonosítást és mennyiségi kiértékelést végezni?

  4. Mit nevezünk fordítottfázisú folyadékkromatográfiának?

  5. Milyen részekből tevődik össze egy HPLC készülék? Jellemezze az egyes részeit.

  6. Milyen egységekből épül fel egy tömegspektrométer?

  7. Ismertesse az elektrospay ionforrás és az ioncsapda analizátor működését!

  8. Mi a tömegspektrum? Milyen információ nyerhető egy tömegspektrumból?

  9. Mi a tandem tömegspektrometria és mi a jelentősége?

  10. Hogyan lehet megoldani a HPLC és az MS készülék közti kapcsolatot?

Ajánlott irodalom

  1. Daniel C. Harris: Quantitative Chemical Analysis, W.H. Freeman and Company, New York, 2007