A molekuláris órák „ketyegési sebessége” kalibrálandó (pl. 0,2%-nyi eltérés/1millió év). Homológ szekvenciák eltéréséből a legközelebbi közös ős kora meghatározható (pl. ha 10% különbség, akkor (10/0,2)/2 = 25 millió év adódik, mert a két korábban elvált ágon azonos változási sebességet feltételezünk).
Problémák:
„Ketyegés” nem állandó sebességű (szelekció erőssége eltérhet, drift). Jobb a nemkódoló DNS-t használni ilyen elemzésekhez, mivel a makromolekulát kódoló szakaszokon eltérő erősségű szelekciós nyomások hathatnak, a nemkódoló szakaszokon valószínűleg egyáltalán nincsen nyomás.
Sok esetben szeretnénk azt is tudni, mikor élt bizonyos fajok „közös őse”.
A „molekuláris órák” olyan aminosavszekvenciák vagy nukleotidszekvenciák, amelyekben az evolúciós változások konstans rátával gyűlnek fel az időben.
Watter M. Fitch – 20 éves periódus alatt hűtőben tárolt influenza A–vírus hemagglutinin génjének egy részletét szekvenálta Þ becsült egy evolúciós fát a nukleotidkülönbségek alapján, majd az évek függvényében ábrázolta a változások számát. Egyenes vonal Þ egyenletesen gyűltek a szubsztitúciók, a hemagglutinin génje tehát „molekuláris óra”.
A „molekuláris órák” gondosan kalibrálandók és körültekintően használandók. Pl. a madarakból átkerült influenzavírusok gyorsabban evolválódtak, mint amelyek maradtak a madarakban – rájuk a humán vírusok „órája” nem alkalmazható.
Kambrium és molekuláris kormeghatározás
„…ahhoz, hogy visszatekintsünk a prekambriumba, csaknem a leglassúbb órára van szükségünk, amelyek a genom felfoghatatlanul konzervatív részében helyezkednek el. Meg kell keresnünk a minden állatban közös genetikai Kollektív Tudattalant.” (Richard Fortrey).
Minél régebben vált el két populáció, annál több szubsztitúciót hordoz a DNS-szekvenciájában. A szekvenciaevolúció tanulmányozása alapján nemcsak az dönthető el, mely populációk a legközelebbi rokonok, hanem az is, mennyire közeli rokonok. Ha tudjuk, hány szubsztitúció akkumulálódik millió évenként, a szubsztitúciók számát evolúciós idővé lehet konvertálni. A vonalak evolúciós korának becslését molekuláris adatokból molekuláris kormeghatározásnak (molecular dating) nevezzük.
A kambriumi robbanás és a prekambriumi lassú tűz hipotézisek esetén a megválaszolandó kérdés az, hogy az állati törzsek diverzifikálódása a kambriumban történt, vagy előtte? A mai élőlények genomja magán viseli ennek a radiációnak a jegyeit. Két különböző törzsbe tartozó faj homológ szekvenciáit összevetve tehát következtetni lehet valami nagyon távolira: az ő közös ősük az előtt élt, mielőtt törzseik elváltak. Ha a kambriumi robbanás hipotézis igaz, akkor az összes, kétoldali szimmetriával rendelkező (bilaterális) törzs egy, rövid radiációból származik, a korai-közép kambrium idejéről. Ha így van, bármely két állati törzs közötti elválás ugyanakkor, feltehetőleg a korai kambriumban, vagy valamivel korábban történt.
Ha azonban a prekambriumi lassú tűz hipotézis igaz, akkor bármely két állati törzs közötti elválás messze a kambrium előtti időkre esik. Így ha bármely két, különböző törzsbe tartozó élőlény szekvenciáit összevetjük, tesztelhetjük a hipotézist.
A törzsek közötti divergencia megállapítására kiválaszthatunk bizonyos géneket, és ősszevethetjük őket a különböző törzsek képviselőinél. Nyilvánvaló, mint a nyitó idézetben is szerepel, ennek alapvető jelentőségű szekvenciának kell lennie, így (1) meg kell lennie minden törzs képviselőiben (2) evolúciójának elég lassúnak kell lennie ahhoz, hogy felismerhetően homológ legyen a vizsgált fajokban. A metionin- adenoziltranszferáz (methionine adenosyltransferase) gén kielégíti a fentieket. Megbecsülték a szubsztitúciók számát, amelyek a szekvenciák között megjelentek, amióta a fajok elváltak egymástól. Ha ismerjük a rátát, amellyel ezek a szubsztitúciók akkumulálódtak, rekonstruálható, milyen hosszú idő telt el azóta, hogy utolsó közös ősük élt.
Szükség van tehát néhány ismert időpontokra, hogy kalkulálható legyen a szubsztitúciók száma millió évenként. Szerencsés körülmény, hogy a puhatestűek közé tartozó kagylófélék jól fosszilizálódnak. Az üledékben, vagy az üledéken élnek, külső vázuk ellenálló, és jegyei alapján a fajok jól elkülöníthetőek. Így nem meglepő, hogy fosszilis anyaguk rendkívül informatív, a két vonal első képviselői 485 millió évesek. A két vonal elválása tehát valamivel ez előtt történhetett, így ez a minimális kora a Mytilus és Nucula kagylóvonalak közös ősének.
Ebben az esetben látható, hogy tíz szubsztitúció jelent meg a két kagyló szekvenciái között. Miután mindegyik vonalban 485 millió év alatt alakultak ki a különbségek, 1 szubsztitúció megközelítőleg 100 millió évenként lépett fel ezekben a vonalakban.
Kiszámítottuk tehát a szubsztitúciós rátát egy ismert divergencia időpontját alapul véve. Ennek ismeretében célunk kiszámítani a puhatestűek és ízeltlábúak közötti hasadás időpontját, így meg kell számolni a szubsztitúciók számát az ízeltlábúak és puhatestűek között, ami 14 szubsztitúciónak adódott. Ha megközelítőleg 100 millió évente 1 szubsztitúcióval számolunk, 1400 millió évre volt szükség a 14 szubsztitúcióhoz. Másképpen fogalmazva: ha a szubsztitúciók rátája megközelítőleg azonos a fa mentén, ez az adat azt mondja, hogy a két törzs 700 millió éve vált el.
A gyakorlatban persze a molekuláris adatokból történő becslés nem annyira egyszerű, mint a példa mutatja. A szubsztitúciók számának és akkumulációjuk rátájának becslése is
meglehetősen trükkös és bonyolult, itt a részletekre nem térünk ki.
A pontos becslés szinte lehetetlen, de a különböző, hasonló jellegű, de nagy körültekintéssel végzett vizsgálatok eredményei mégis sokat elmondanak. A molekuláris eredményekből származó eredményeket így összegezhetjük: a különböző törzsekből származó élőlények DNS-szekvenciáinak összehasonlító elemzése arra utal, hogy több szubsztitúciót tartalmaznak, mint 530 millió éves evolúció alapján várható lenne. Az egyik lehetséges magyarázat, hogy a vonalak jóval a kambrium előtt divergáltak, de nincsenek bizonyítékaink legkorábbi történetükre. A hipotézis támogatásához átgondolandó, miért nem kerültek elő, vagy miért nem kerültek azonosításra bilateráliák a prekambriumból?
Alternatív hipotézis, hogy a molekuláris evolúciós ráták annyival gyorsabbak voltak az állatok radiációjának kezdetén, hogy a kambrium utáni rátákon alapuló becslések messze túlbecsülik az új törzsek korát. A hipotézis támogatásához jó okot kellene találni rá, miért volt a kezdetekben az állati vonalaknak gyorsabb evolúciós rátája.
Sok paleontológus úgy gondolja, hogy számos bizonyíték szól amellett, hogy az állati vonalak eredetét valahol 700-600 millió évvel ezelőtt kell keresnünk a fellelt fosszilizált embriók, nyomfosszíliák és biomarkerek alapján. További érdekes egybeesés, hogy a gombák és növények soksejtű formái is ekkor bukkannak fel. A legtöbb molekuláris szintű vizsgálat is erre az időszakra utal. Kevesen vitatják, hogy a kambrium határán történnie kellett valaminek: a héjakkal, pajzsokkal, fogakkal rendelkező metazoák nyomait, ha korábban jelentek volna meg, biztosan látni lehetne a fosszíliák között. A molekuláris adatok valószínűleg jól azonosítják be a vonalak eredetének időpontját, míg a fosszíliák szépen illusztrálják a diverzitás és komplexitás drámai növekedését. A hipotézisek tesztelése az evolúciós biológiában általában megkívánja, hogy az összes lehetséges eredmény kombináljuk, erre szép példa a törzsek eredetének páratlanul izgalmas problémája is.
Hasonlóan érdekes probléma az emlősök és madarak radiációja is. A jelek szerint 30 millió évvel a dinoszauruszok kihalása előtt mindkét csoportnál komoly diverzifikáció zajlott, aminek (legalább) az apróbb dinoszauruszokra feltétlenül jelentős hatása lehetett.